Исследователи разработали MEDY — новый химический коктейль, позволяющий замораживать и размораживать ткани мозга, не повреждая их. После предварительного замачивания в растворе и последующего криогенного консервирования в жидком азоте клетки восстанавливали нормальную работу в течение 18 месяцев после заморозки. Этот метод сохранения должен значительно расширить доступ к высококачественным образцам мозга для биомедицинских исследований.
Одним из самых значительных достижений в биомедицинских исследованиях за последние годы стало выращивание органоидов. В частности, эти кластеры клеток позволили воспроизвести большинство заболеваний мозга, что дает возможность изучать их биомолекулярные механизмы и разрабатывать новые лекарства. Однако их доступность значительно ограничена из-за времени и высокой стоимости выращивания, а также проблем, связанных с их сохранением.
Исследования показали, что как бы быстро ни замораживали мозговую ткань, переход от замораживания к оттаиванию всегда приводит к повреждению тканей. Сохранить органоиды мозга со специфическими патологическими характеристиками путем замораживания крайне сложно, поскольку после размораживания функционирует очень мало нейронов. Поэтому многие исследования проводятся сразу после получения образцов тканей.
С другой стороны, технологии криоконсервации позволяют эффективно сохранять эмбриональные стволовые клетки, гаметы и эмбрионы. После криоконсервации и размораживания бычья сперма, например, может быть оплодотворена in vitro. После пересадки в организм самки полученные эмбрионы успешно развиваются.
Однако криоконсервация органоидов мозга со сложной цитоархитектурой представляет собой серьезную проблему. Методы, используемые для двумерных сборок клеток и ненейронных органоидов, не подходят для нейронных органоидов и живой ткани человеческого мозга в целом (из-за их очень сложной архитектуры).
Исследователи из Фуданьского университета в Китае нашли способ обойти эти проблемы, предварительно замочив органоиды мозга в специальном растворе перед их криогенным консервированием. Новая методика позволила сохранить крупные, разнообразные кластеры коры головного мозга, которые сохранили свою структурную целостность и функции даже после удивительно долгого времени криоконсервации.
Непрерывный рост в течение 150 дней
Чтобы разработать решение для консервации, исследователи из Фуданьского университета протестировали различные химические комбинации. Ингредиенты были выбраны на основе их способности сохранять морфологическую целостность органоидов после размораживания, уменьшать потерю нейронных клеток и способствовать росту нейритов (выступов из клеточного тела нейрона: аксона или дендрита). Эти ингредиенты включают метилцеллюлозу, этиленгликоль, поливинилпирролидон, трегалозу, глюкозу, сахарозу и пролин.
Органоиды головного мозга культивировались в течение 21 дня с использованием эмбриональных стволовых клеток человека. Это время роста позволяет клеткам дифференцироваться в нейронные прогениторные клетки и функциональные нейроны. После погружения в различные комбинации консервирующих растворов полученные органоиды были криогенно заморожены в жидком азоте на 24 часа, а затем быстро разморожены в теплой воде. После многочисленных попыток и циклов замораживания-оттаивания эксперты пришли к выводу, что наиболее эффективным является сочетание этиленгликоля, метилцеллюлозы, диметилсульфоксид и Y27632 (MEDY).
Вторая часть исследования включала оценку эффективности раствора MEDY на различных типах органоидов, характерных для различных областей центральной нервной системы, включая дорсальный и вентральный передний мозг, спинной мозг и зрительный нерв (OVB). Также варьировался возраст органоидов (от 4 недель до 3 месяцев) и длительность их предварительной обработки в растворе. Методика также была протестирована на органоидах, полученных от пациентов с эпилепсией.
Исследователи обнаружили, что после каждого цикла крионического размораживания органоиды сохраняли функции, аналогичные тем, которые никогда не подвергались заморозке. Клеточные кластеры исправно выполняли свои функции, даже если их размораживали через 18 месяцев, и продолжали расти в течение примерно 150 дней.
Более того, органоиды, полученные от больных эпилепсией, после размораживания сохраняли те же патологические характеристики. Транскриптомные анализы показали, что раствор сохранял синаптические функции и подавлял путь апоптоза, опосредованный эндоплазматическим ретикулумом.
Исследовательская группа полагает, что метод может быть распространен на более крупные образцы мозга, что потенциально может стать благом для исследований в этой области. «MEDY позволит надежно и масштабно хранить разнообразные нейронные органоиды и живые ткани мозга и будет способствовать проведению масштабных исследований, применению в медицине и разработке лекарств«, — заключают исследователи в своем отчете, опубликованном в журнале Cell Reports Methods.
